Invertzucker wird durch Zugabe kleiner Mengen Säure als Katalysator zu in heißem Wasser gelöster Saccharose (Rüben- oder Rohrzucker) oder durch Behandlung mit Invertase hergestellt. Die Saccharose-Moleküle, die als Disaccharide aus je einem Trauben- und einem Fruchtzuckermolekül zusammengesetzt sind, werden dabei wieder in ihre beiden Monosaccharid-Bestandteile zerlegt:
Dieser chemische Vorgang wird als Hydrolyse (der spezielle Fall als Rohrzuckerinversion) bezeichnet. Mit Hilfe von polarisiertem Licht kann man mit einem Polarimeter laufend verfolgen, wie weit die Reaktion fortgeschritten ist. Am Anfang besteht die Probe fast nur aus Saccharose, welche einen spezifischen Drehwinkel von +66,5° besitzt. Mit fortschreitender Reaktion zerfällt die Saccharose in Glucose mit +52° und Fructose −92° spezifischem Drehwinkel. Da sich die Drehrichtungen beider Substanzen überlagern, hat der fertige Invertzucker einen spezifischen Drehwinkel von −20°, also das arithmetische Mittel zwischen den beiden weit auseinanderliegenden Einzelwerten.
Invertzucker kann auch durch Mikroorganismen (bestimmte Hefestämme) oder mit immobilisierter Invertase hergestellt werden.