Um die Hydroxylzahl experimentell zu ermitteln, wird eine entsprechende Masse des zu untersuchenden Materials (z. B. Hartfett) genau eingewogen. Anschließend wird ein Acetylierungsgemisch aus Acetanhydrid und wasserfreiem Pyridin im Überschuss zugesetzt (Verhältnis 1:3) und eine Stunde im Wasserbad erhitzt. Je eine Hydroxygruppe (des Fetts) reagiert währenddessen mit Acetanhydrid zur acetylierten Hydroxygruppe und je einem Molekül Essigsäure. Alle dabei nicht verbrauchten Acetanhydrid-Moleküle werden im nächsten Schritt mit Wasser zu je zwei Essigsäuremolekülen umgesetzt. Anschließend erfolgt Neutralisierung mit ethanolischer KOH-Lösung und Phenolphthalein.
Das Gleiche wiederholt man ohne den Analyten (Blindwert), dann wird jedes Molekül Acetanhydrid zu zwei Molekülen Essigsäure umgesetzt – entsprechend mehr KOH benötigt man, um die entstehende Essigsäure zu neutralisieren. Im Hauptversuch mit dem Analyten entsteht für jede darin vorhandene Hydroxygruppe, genau ein Molekül an Essigsäure weniger. Über diesen Zusammenhang lässt sich die OHZ bestimmen. Wichtig ist der Zusammenhang: n (OH-Gruppen) = n (Essigsäure, die weniger entsteht) = n (KOH, die für die Essigsäure im Hauptversuch weniger verbraucht wird).