Lysozym

Zu Lysozymen gibt es mehrere tausend wissenschaftliche Publikationen. Hier wird auf einige der ersten Veröffentlichungen und auf solche, die über den Forschungsbereich Lysozyme hinaus von Bedeutung sind, kurz eingegangen.

Die antibakterielle Eigenschaft von Hühnereiklar, die auf Lysozym zurückzuführen ist, wurde erstmals 1909 von Laschtschenko beschrieben. Der Begriff „Lysozym“ wurde allerdings erst 1922 durch Alexander Fleming (1881–1955) eingeführt, der damit dem Enzym den Namen gab. Er beobachtete die antibakterielle Wirkung von Lysozym im Nasenschleim auf das Bakterium Micrococcus lysodeikticus und konnte diese Wirkung auch bei weiteren humanen Sekreten und Geweben feststellen.

Das Lysozym aus Hühnereiklar war das erste vollständig sequenzierte Enzym, das alle kanonischen Aminosäurereste enthielt. Die mit Röntgenstrukturanalyse bestimmte dreidimensionale Struktur von Lysozym aus Hühnereiklar (HEWL) wurde 1965 von David Chilton Phillips (1924–1999) erstmals beschrieben. Es war die zweite Struktur eines Proteins sowie die erste eines Enzyms, die durch Röntgenstreuung bestimmt werden konnte. Lysozym war auch das erste Enzym, anhand dessen Struktur ein für das Enzym spezifischer und detaillierter Katalysemechanismus vorgeschlagen wurde. Diese Arbeit lieferte eine Erklärung, wie Enzyme durch ihre Struktur die Aktivierungsenergie einer chemischen Reaktion absenken. Der von Phillips vorgeschlagene Mechanismus wurde lange Zeit durch experimentelle Befunde gestützt und wurde erst 2001 auf Grund neuer Erkenntnisse überarbeitet.

Die Zuordnung der Lysozyme zu den verschiedenen Typen erfolgt anhand ihrer Aminosäuresequenz sowie aufgrund ihrer biochemischen und enzymatischen Eigenschaften. In der Klassifikation nach Henrissat gehören Lysozyme zu den der Glycosidase Familien 22 bis 25 und lytische Transglycosidasen zu den Glycosidase-Familien 23, 102, 103 und 104.

Neben Lysozymen und lytischen Transglycosidasen gibt es weitere Peptidoglycan abbauende Enzyme, wie N-Acetyl-β-D-glucosaminidasen, N-Acetylmuramyl-L-alaninamidasen und verschiedene Endopeptidasen.

Bei Tieren wurden drei sich voneinander unterscheidende Haupttypen von Lysozymen identifiziert, die gewöhnlich als c-Typ (chicken- oder conventional-type), g-Typ (goose-type) und als i-Typ (invertebrate-type) bezeichnet werden. Daneben gibt es noch Lysozyme, die sich keinem der zuvor genannten Typen zuordnen lassen, wie beispielsweise die von Dictyostelium discoideum (UniProt Q8T1G4) oder des Schwamms Suberites domuncula (UniProt Q50JA0). Virale Lysozyme werde in v-Typ, λ-Typ, g-Typ und CH-Typ eingeteilt. Einige virale Enzyme werden aus historischen Gründen noch als Lysozyme bezeichnet, obwohl diese keine β-1,4-N-Acetylmuramidasen sind. Die bei Pflanzen entdeckten Lysozyme haben alle eine Chitinase-Aktivität, aber nicht alle Chitinasen können Peptidoglycane hydrolysieren. Sie werden in h-Typ und g-Typ Chitinasen/Lysozyme eingeteilt. Bei vielen pflanzlichen Chitinasen wurde die Lysozym-Aktivität noch nicht untersucht und einige können aufgrund fehlender Sequenzinformationen nicht zugeordnet werden. Lysozyme bei Bakterien werden funktionell in β-1,4-N-Acetylmuramidasen und in β-1,4-N,6-O-Diacetylmuramidasen unterschieden.

Das natürliche Substrat von Lysozymen ist ein unlösliches Peptidoglycanpolymer mit einer hohen molaren Masse, das meist die Zellwand von Bakterien verstärkt, damit diese dem hohen Zellinnendruck widerstehen. Zur Messung der Lysozymaktivität wird häufig dieses große Biopolymer eingesetzt. Dazu werden beispielsweise getrocknete und UV-inaktivierte Zellen von Micrococcus luteus eingesetzt. Aufgrund der Unlöslichkeit und Komplexität des Substrats können die Reaktionskinetiken nicht als Michaelis-Menten Kinetik beschrieben werden.

Für spezifische Messungen der Lysozymaktivität müssen entweder spezielle Substrate eingesetzt oder die Produkte untersucht werden. Um Probleme mit der Unlöslichkeit und Heterogenität des Substrats bei Zellen oder Zellwandpräparationen zu umgehen, werden auch lösliche Oligosaccharide und Muropeptide eingesetzt.

Gewöhnlich wird eine der folgenden drei unspezifische Methoden eingesetzt.

N-Deacetylierung und O-Acetylierung sind häufige Modifizierungen von Peptidoglycan bei pathogenen Bakterien, die zumindest bei Listeria monocytogenes und Staphylococcus aureus zur Lysozymresistenz beitragen. Eine weitere Strategie ist die Produktion von Lysozym-Inhibitoren, wie im Periplasma von E. coli (UniProt P0AD59, PDB 1GPQ) oder an die äußere Membran gebunden wie bei Pseudomonas aeruginosa (UniProt Q9I574, PDB 3F6Z).

Imidazol, Indole, NAG, (NAG)₂, (NAG)₃

Tierische Lysozyme sind globuläre Proteine, die durch eine große Substratbindungsspalte in zwei Domänen geteilt sind, eine größere α-helikale Domäne, in der sich Amino- und Carboxyterminus des Proteins befinden, und eine kleinere β-Faltblatt-Domäne. Diese Art gemischter α+β-Faltung wird als Lysozym-ähnliche Faltung bezeichnet. In c-Typ-Lysozymen befinden sich acht konservierte Cysteinreste, die vier Disulfidbrücken ausbilden. In g-Typ-Lysozymen bei Säugetieren und Vögeln befinden sich vier bis sieben Cysteinreste, bei einigen Fischen jedoch nur ein bzw. kein Cysteinrest, und bei Wirbellosen sechs bis dreizehn Cysteinreste, von denen jedoch keiner denen bei Säugetieren und Vögeln entspricht. Über die Gegenwart und Lage von Disulfidbrücken bei g-Typ-Lysozymen von Wirbellosen ist noch nichts bekannt. Ein hoher Anteil von Cysteinresten scheint bei i-Typ-Lysozymen typisch zu sein. Im Lysozym der Venusmuschel Venerupis philippinarum bilden beispielsweise alle 14 Cysteinreste Disulfidbrücken aus. Die tierischen c- und i-Typ-Lysozyme sind etwa 11 bis 15 kDa groß, g-Typ-Lysozyme etwa 20 bis 22 kDa. Die anhand der Sequenz berechneten isoelektrischen Punkte der c- und g-Typ-Lysozyme liegen im basischen Bereich, der der i-Typ-Lysozyme sind variabler. An der Verdauung beteiligte c- und i-Typ-Lysozyme haben meist einen pI im neutralen oder sauren Bereich.

CH-Typ-Lysozyme und h-Typ-Chitinasen haben Strukturen eines α/β-Hydrolase-Faltungstyps, der der TIM-barrel-Faltung zugeordnet werden kann. Sie sind etwa 22 bis 40 kDa groß, wobei die größeren neben der Lysozym-Domäne auch mehrere unabhängig faltende Domänen besitzen, die eine Substrat-bindende Funktion haben, wie beispielsweise beim Streptococcus-Phagen Cp-1. Modulare Proteine können auch bei Bakterien gefunden werden.

Die viralen v-, λ- und g-Typ-Lysozyme sind häufig etwa 17 bis 19 kDa groß. Es gibt auch größere an Viruspartikel gebundene Lysozyme, die an der Infektion beteiligt sind.

Neben der Lysozym-Aktivität konnte bei einigen i-Typ Lysozymen eine Isopeptidase-Aktivität festgestellt werden. Sie hydrolysieren die Isopeptidbindungen, die zwischen der γ-Carboxamidgruppe eines Glutaminrestes und der ε-Aminogruppe eines Lysinrestes gebildet wurde. Diese werden zum Beispiel zwischen Fibrin-Molekülen durch den Fibrinstabilisierender Faktor gebildet. Diese Aktivität wurde beispielsweise beim Blutegel nachgewiesen und verhindert, dass das Blut koaguliert. Ob diese Funktion auch bei anderen Wirbellosen von Bedeutung ist oder sogar die Isopeptidbindungen einiger Peptidoglycane gespaltet wird, ist noch unklar.

HEWL wird aus dem Eiklar von Hühnereiern gewonnen und gefriergetrocknet gehandelt. Mehr als 100 t werden jährlich produziert. Auch das Lysozym von Streptomyces coelicolor wird durch Submersfermentation in größeren Mengen gewonnen und in den Handel gebracht (Cellosyl ^®). Humanes Lysozym wird aus neutrophilen Granulozyten, aus Milch und rekombinant, beispielsweise aus gentechnisch verändertem Reis, gewonnen. Auch die Gewinnung von humanem Lysozym C aus der Milch von Kühen ist inzwischen möglich.

In der Lebensmittelindustrie wird Lysozym zur Konservierung oder beispielsweise in der Weinbereitung zur Kontrolle des biologischen Säureabbaus (Malolaktische Gärung) eingesetzt. Als Konservierungsmittel ist es in der EU als Lebensmittelzusatzstoff der Nummer E 1105 für gereiften Käse und zur Konservierung von Bier, das weder pasteurisiert noch sterilfiltriert wurde, zugelassen. Bei Käse wird die Rissbildung in der Käsekrume (sog. Spätblähung) durch Clostridium tyrobutyricum oder Clostridium botulinum verhindert.

Beim Bier soll die Vermehrung von Milchsäurebakterien verhindert werden. Die meisten Brauereien unterziehen ihr Bier dem Verfahren der Sterilfiltration oder der Pasteurisierung, um zu verhindern, dass es während der Lagerung und vor dem Verzehr zu bakteriellem Verderb kommt. Bei einigen Bierspezialitäten, wie obergärigen nachgärenden Bieren, z. B. Fass- oder Flaschenbier, können diese Verfahren nicht angewandt werden, weil die vorhandenen lebensfähigen Mikroorganismen bei diesen Bieren Teil des Herstellungsverfahrens sind.

Ein in der Entwicklung befindlicher Anwendungsbereich ist der Einsatz von HEWL in sogenannten „aktiven“ Lebensmittelverpackungen, um die Haltbarkeit bestimmter Lebensmittel zu verlängern. Es gibt transgene Ziegen, Schweine und Rinder, die humanes Lysozym in ihrer Milch produzieren und von denen man sich eine verbesserte Tiergesundheit, eine erhöhte Lebensmittelsicherheit und Haltbarkeit verspricht.

Lysozym wird zum Aufschluss von Bakterienzellen eingesetzt. Zum Aufschluss gramnegativer Bakterien mit HEWL kann EDTA zur Permeabilisierung der Außenmembran hinzugegeben werden.

Außerdem kann die heterologe Expression von humanem Lysozym in Pflanzen zu einer gesteigerten Resistenz gegen Bakterien und Pilzen führen.

Es wird ein Zusammenhang zwischen reduzierter Lysozymaktivität und bronchopulmonaler Dysplasie bei Neugeborenen vermutet. Kleinkinder, in deren Nahrung Lysozym fehlt, erkranken häufiger an Durchfallerkrankungen. Defensine und Lysozym schützen die Bindehaut des Auges vor Bakterien, so dass Defizite zu Bindehautentzündungen führen können. Mutationen am LYZ-Gen können zur sehr seltenen familiären Amyloidose führen.

Erhöhte Lysozymkonzentrationen im Blutserum treten bei chronischen bakteriellen Infektionen, wie zum Beispiel Tuberkulose, bei Sarkoidose, Morbus Crohn, AIDS, rheumatoider Arthritis sowie bei monocytischer und monomyelocytischer Leukämie auf. Bei Harnwegsinfektionen, bestimmten Nierenschäden und bei exzessiver endogener Lysozymproduktion, die die Reabsorptionskapazität des proximalen Tubulus überschreitet, sind erhöhte Lysozymwerte im Harn nachweisbar. Bei bakterieller Meningitis und bei Tumoren des zentralen Nervensystems können erhöhte Werte in der Zerebrospinalflüssigkeit nachgewiesen werden. Bei bakterieller Meningitis sind beispielsweise 5- bis 400-fach erhöhte Werte feststellbar. Bei entzündlichen Erkrankungen des Magen-Darm-Trakts, wie beispielsweise Morbus Crohn, bei Gastroenteritis durch bakterielle oder Rotavirusinfektionen und bei Darmkrebs wurden erhöhte Lysozymmengen in Kot nachgewiesen. Auch im Speichel kann die Lysozymkonzentration erhöht sein. Die Lysozymkonzentration bzw. -menge kann in diesen Fällen als Marker dienen, um den Krankheitsverlauf zu verfolgen, den Therapieerfolg zu beurteilen und Rückfälle festzustellen.

In den Publikationen von Brouwer u. a. (1984) und Porstmann u. a. (1989) wurden für Lysozym folgende Referenzbereiche angegeben.

Serum

• Neugeborene 800–4600 µg/l
• Erwachsene(18–40 Jahre) 450–2950 µg/l
• Erwachsene(41–70 Jahre) 1100–2900 µg/l
• Erwachsene(18–60 Jahre) 950–2450 µg/l

Urin

• Frauen 0,45–20,1 µg/l
• Männer 0,33–6,4 µg/l
• 1,7–123 µg/l

Zerebrospinalflüssigkeit

• 17,6–118 µg/l

Kot

• 0,04–1,5 µg/g

Die therapeutische Wirksamkeit von Lysozym (HEWL) beruht einerseits auf seiner enzymatischen Aktivität, die es erlaubt, das Wachstum empfindlicher Bakterien zu kontrollieren. Darüber hinaus moduliert Lysozym die Immunantwort bei Infektionen, stimuliert das Immunsystem und wirkt entzündungshemmend. Dadurch wirkt es gegen virale Infektionen, verstärkt die Wirkung von Antibiotika und kann bei der Krebsbehandlung und bei einem geschwächten Immunsystem eingesetzt werden. Lysozym wird meist oral verabreicht. Lysozym ist in manchen Halsschmerztabletten enthalten. Allerdings fehlt hier ein echter Wirknachweis. Lysozym aus Hühnereiern kann bei bestehender Hühnereiweißallergie eine Reaktion auslösen.