Zur Herstellung von Hefeextrakt nimmt man überwiegend eiweißreiche, speziell gezüchtete Heferassen (Reinzuchthefe) insbesondere von Backhefe und Torula, aber auch Bierhefe aus der Brauerei, Molke- und Futterhefen. Der Aufschluss der Zellen und die damit verbundene Freisetzung des Zellsaftes erfolgt in der Regel durch Autolyse, das heißt die Selbstauflösung abgetöteter Hefezellen. Die hefeeigenen Proteasen und Hydrolasen hydrolysieren dann die Zellinhalte, wodurch Proteine in Peptide und Aminosäuren, DNA und RNA zu Nukleotiden aufgespalten werden. Um einen höheren Nukleotidgehalt zu erzielen, können die hefeeigenen Enzyme durch Zugabe von Nucleasen ergänzt werden. Dies kann unter anderem deswegen wünschenswert sein, weil die Ribonucleotide Guanosinsäure und Inosinsäure und ihre Salze die geschmacksverstärkende Wirkung des Hefeextraktes vervielfachen.
Neben der Autolyse kann die Freisetzung der Zellinhalte auch durch Thermolyse erfolgen, wobei die Hefezellen in Wasser erhitzt werden, oder durch Plasmolyse mit hypertonischer Kochsalz- oder Zuckerlösung. Die Verfahren werden auch kombiniert, etwa indem die Autolyse durch „Aufschmelzen“ der Zellmembranen bei moderater Hitze unterstützt wird. Prinzipiell ist auch eine säurehydrolytische Gewinnung mit Salzsäure möglich (anstatt der enzymatischen Hydrolyse), aber dann darf das Resultat nicht als Hefeextrakt bezeichnet werden.
Das anfänglich flüssige Auto- bzw. Hydrolysat wird im weiteren Verlauf von den unlöslichen Zellbestandteilen befreit, filtriert, aufkonzentriert und gegebenenfalls sprühgetrocknet, so dass ein Trockensubstanzgehalt von 70–80 % bei pastösem Hefeextrakt, 95–97 % bei Pulver erreicht wird.
