In der Milch der Säugetiere sowie in Milcherzeugnissen macht Lactose fast den gesamten Anteil der Kohlenhydrate aus. Der Lactoseanteil in Milchprodukten variiert aufgrund des Herstellungsprozesses. Bei der Käseherstellung wird ein Teil der Lactose mit der Molke abgetrennt und durch Reifung weiter abgebaut. Frischkäsesorten haben daher einen Lactoseanteil von mehr als 2 % und länger gereifte Hartkäsesorten oft weniger als 0,1 % Lactose.
Kuhmilch enthält bis zu 47 g/l Lactose. Sie wird aus Süß- oder Sauermolke gewonnen, die in großen Mengen als Nebenprodukt bei der Käseherstellung anfällt. Durch Erhitzen, Ultrafiltration und Ionenaustausch wird die Molke hierfür von Lipiden, Proteinen und Mineralstoffen befreit und im Vakuum eingeengt. Aus der konzentrierten Lösung kristallisiert dann Lactose-Monohydrat (siehe Abbildung unten rechts).
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