Nach einer EU-Verordnung muss Butter zu mindestens 80 Prozent aus Milchfett bestehen. Ein Wassergehalt von 16 Prozent darf nicht überschritten werden, damit das Milcherzeugnis als Butter verkauft werden darf. Weitere Inhaltsstoffe der Butter sind die Milchbestandteile Milchzucker, Mineralstoffe, Cholesterin, Phospholipide, Proteine, fettlösliche Vitamine, Milchsäure und Aromastoffe.
Charakteristisch für Butter ist ein vergleichsweise hoher Gehalt an Glyceriden der Ölsäure und kurzkettiger gesättigter Fettsäuren, (vorr. Buttersäure). Der Brennwert beträgt etwa 3100 kJ (entspr. 740 kcal) pro 100 g.
Die Fütterung der Kühe wirkt sich auf die Inhaltsstoffe der Butter aus. Bekommen die Kühe viel Grünfutter, enthält die Butter mehr Omega-3-Fettsäuren. Mais und Kraftfutter senken die Gehalte an Omega-3-Fettsäuren. Je höher der Anteil des Grünfutters im Vergleich zum Kraftfutter, desto mehr ungesättigte Fettsäure und Vitamine enthalten die Milch und damit auch die Butter.